|
Главная →
Энзимология
Определение активности слюныМетод определения протеолитической активности плазмы крови по гидролизу протаминсульфата можно использовать и для определения протеиназ в другой биологической жидкости — можно определить активность слюны и секрета слюнных желез. Объектом исследования может служить как смешанная слюна, полученная натощак (без раздражителя), отдельные ее фракции (жидкая часть, осадок), полученные при центрифугировании слюны при 3000 об/мин, так и секрет околоушной железы. Его собирают натощак путем раздражения железы 2% раствором лимонной кислоты. Реактивы:
Ход определения. В опытные пробирки вносят 0,25 мл смешанной слюны (надосадочной жидкости) или секрета околоушной железы, затем добавляют 0,55 мл 0,05 М мединалового буфера, рН 7,6, и 0,2 мл 1 % раствора протаминсульфата. Опытные пробы инкубируют в водяном термостате при 35° С в течение 30 минут, затем прибавляют 1 мл 20% раствора ТХУ. Контрольные пробы исследуют аналогично, но 0,2 мл протаминсульфата, инкубированного 30 мин при 35°С, добавляют после ТХУ. После 45-минутного центрифугирования проб при 5000 об/мин в безбелковых центрифугатах определяют количество аргинина. ПРА слюны (секрета) выражают в нмоль аргинина, освобожденного из протаминсульфата под действием 1 мл (или мг белка) слюны (секрета) за 1 мин. Пример расчета. Оптическая плотность опытной пробы составляет 0,17, что по калибровочной кривой соответствует 7 мкг аргинина. Общий объем пробы — 2 мл, время инкубации — 30 минут, на определение брали 0,25 мл слюны, молекулярная масса аргинина— 174,2, в 1 мл слюны (секрета) содержится 1,2 мг белка, 1000 — коэффициент пересчета на нмоль. Следовательно, ПРА данного образца слюны равна: ПРА = (7*2*1000)/(0,25*30*174,2) = 10 нмоль аргинина / (мл слюны * мин) ПРА = 10/1,2 = 8,3 нмоль аргинина / (мг белка * мин) В норме ПРА смешанной слюны составляет в среднем 9,1 нмоль аргинина/ (мл слюны*мин), удельная активность — 7,1 нмоль/(мг белка*мин). ПРА секрета околоушной железы у здоровых людей равна 2,6 нмоль/ (мл секрета*мин), удельная активность 3,1 нмоль/ (мг белка*мин).
|
|
|