Определение лизоцима в слюне

Метод основан на способности лизоцима слюны и секретов слизистой оболочки носа расщеплять полисахариды клеточной оболочки бактерий Micrococcus Lysodeikticus. Активность фермента определяют нефелометрически по изменению мутности суспензии Micrococcus Lysodeikticus.

Реактивы:

• Ацетоновый порошок культуры М. Lysodeikticus. 20 мг препарата тщательно растирают в небольшом объеме 1/15 M фосфатного буфера, рН 6,25, затем приливают буфер до объема 100 мл.
• 1/15 М K-Na-фосфатный буфер, рН 6,25. 136,15 г КН2РО4 растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. 178,4 г двузамещенного Na2HPO4 растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Смешивают 70 мл КН2РО4 (1 М) и 30 мл Na2HPO4, затем разбавляют полученный буфер до концентрации 1/15 M. рН раствора контролируется при помощи рН-метра.
• Кристаллический лизоцим. 5 мг препарата растворяют в 5 мл 1/15 M фосфатного буфера, рН 6,25 (исходный раствор). Его хранят в холодильнике в течение 2 недель при +4° С. Непосредственно перед опытом исходный раствор разбавляют фосфатным буфером до концентрации 2 мкг/мл.
• Смешанная слюна.
• Секрет слизистой носа.

Ход определения. В опытные пробы вносят по 0,1 мл смешанной слюны, разбавленной в 2 раза 0,9% раствором NaCl (или 0,1 мл секрета слизистой носа), прибавляют 0,9 мл буфера, рН 6,25, и 5 мл субстрата — Micrococcus Lysodeikticus. Пробы инкубируют 30 минут при 37°С, после чего сразу же фотометрируют Против 1/15 M фосфатного буфера, рН 6,25 на нефелометре в кюветах с толщиной слоя 10 мм при использовании светофильтра. Активность исследуемого фермента слюны (секрета) выражают в мкг кристаллического лизоцима/мг белка за 30 минут инкубации при 37°С. Для перехода от показателей светопропускания к количеству (мкг) лизоцима строят калибровочную кривую. Для этого берут серию пробирок, в которые вносят от 0,2 до 1 мл лизоцима (0,2-2 мкг), доводят объем проб до 1 мл 1/15 M фосфатным буфером, рН 6,25, и добавляют 5 мл М. Lysodeikticus. Контрольная проба состоит из 1 мл 1/15 М буфера, рН 6,25, и 5 мл М. Lysodeikticus. После инкубации опытных и контрольных проб в течение 30 минут при 37°С их фотометрируют против 1/15 M буфера, рН 6,25. На основании полученных данных строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают количество лизоцима в пробе (мкг), на оси ординат — процент светопропускания.

Пример расчета. Процент светопропускания опытной пробы равен 70, что по калибровочной кривой соответствует 1,6 мкг лизоцима. В пробу брали 0,1 мл слюны, разбавленной в 2 раза, содержание белка слюны — 2 мг.

Содержание лизоцима = (1,6*1*2)/(0,1*2) = 16 мкг /мг белка.

В норме уровень лизоцима в слюне составляет 15 мкг/мг белка, в секрете слизистой носа — 45 мкг/мг белка.