ГлавнаяЭнзимология

Определение активности слюны

Метод определения протеолитической активности плазмы крови по гидролизу протаминсульфата можно использовать и для определения протеиназ в другой биологической жидкости — можно определить активность слюны и секрета слюнных желез.

Объектом исследования может служить как смешанная слюна, полученная натощак (без раздражителя), отдельные ее фракции (жидкая часть, осадок), полученные при центрифугировании слюны при 3000 об/мин, так и секрет околоушной железы. Его собирают натощак путем раздражения железы 2% раствором лимонной кислоты.

Реактивы:

  • Слюна для исследования.
  • 3,8% раствор лимоннокислого Na.
  • Мединаловый буфер 0,05 М, рН 7,6. 10,3 г мединала растворяют в 500 мл дистиллированной воды, 61,5 мл этого раствора смешивают с 38,5 мл НСl и добавляют дистиллированную воду до 200 мл.
  • 1% раствор протаминсульфата. Пригодны препараты субстрата с минимальным количеством аргининсодержащих пептидов. Для определения возможности использования препаратов протаминсульфата ставят пробу на наличие в них пептидов, растворимых в трихлоруксусной кислоте (ТХУ) и дающих цветную реакцию Сакагуши. С этой целью к 0,2 мл 1% раствора протаминсульфата прибавляют 0,6 мл мединалового буфера, 0,05 М, рН 7,6, и 0,8 мл 20% раствора ТХУ. Пробы центрифугируют при 5000 об/мин в течение 40 мин и в 1 мл ТХУ центрифугата определяют содержание аргинина по цветной реакции Сакагуши спектрофотометрически при 508 нм в кюветах толщиной слоя 10 мм против контроля на реактивы (0,5 мл мединалового буфета + 0,5 мл 20% ТХУ + реактивы для реакции Сакагуши). Оптическая плотность пробы, характеризующая количество аргининсодержащих пептидов применяемого препарата протаминсульфата, не должна превышать 0,25. Если она выше указанного показателя, то такие препараты субстрата не пригодны. Для приготовления 1% раствора протаминсульфата непосредственно перед опытом навеску препарата тщательно растирают в 0,05 М мединаловом буфере, рН 7,6 в течение 15 минут.
  • 20% раствор ТХУ.
  • 0,02% раствор оксихинолина. 20 мг перекристаллизованного оксихинолина растворяют в 10 мл этилового спирта (96°) и хранят при температуре +4° С, перед опытом его разбавляют в 10 раз дистиллированной водой.
  • 10% раствор NaOH.
  • 1 % раствор NaBrO 1 г (0,32 мл) брома растворяют в 100 мл 5% раствора NaOH.
  • 40% раствор мочевины.
  • Аргинин солянокислый. Используют для построения калибровочной кривой.

Ход определения. В опытные пробирки вносят 0,25 мл смешанной слюны (надосадочной жидкости) или секрета околоушной железы, затем добавляют 0,55 мл 0,05 М мединалового буфера, рН 7,6, и 0,2 мл 1 % раствора протаминсульфата. Опытные пробы инкубируют в водяном термостате при 35° С в течение 30 минут, затем прибавляют 1 мл 20% раствора ТХУ. Контрольные пробы исследуют аналогично, но 0,2 мл протаминсульфата, инкубированного 30 мин при 35°С, добавляют после ТХУ. После 45-минутного центрифугирования проб при 5000 об/мин в безбелковых центрифугатах определяют количество аргинина.

ПРА слюны (секрета) выражают в нмоль аргинина, освобожденного из протаминсульфата под действием 1 мл (или мг белка) слюны (секрета) за 1 мин.

Пример расчета. Оптическая плотность опытной пробы составляет 0,17, что по калибровочной кривой соответствует 7 мкг аргинина. Общий объем пробы — 2 мл, время инкубации — 30 минут, на определение брали 0,25 мл слюны, молекулярная масса аргинина— 174,2, в 1 мл слюны (секрета) содержится 1,2 мг белка, 1000 — коэффициент пересчета на нмоль. Следовательно, ПРА данного образца слюны равна:

ПРА = (7*2*1000)/(0,25*30*174,2) = 10 нмоль аргинина / (мл слюны * мин)

ПРА = 10/1,2 = 8,3 нмоль аргинина / (мг белка * мин)

В норме ПРА смешанной слюны составляет в среднем 9,1 нмоль аргинина/ (мл слюны*мин), удельная активность — 7,1 нмоль/(мг белка*мин). ПРА секрета околоушной железы у здоровых людей равна 2,6 нмоль/ (мл секрета*мин), удельная активность 3,1 нмоль/ (мг белка*мин).

Все материалы на сайте размещены для справки. Перед началом лечения проконсультируйтесь с врачом.