Определение активности сыворотки крови

Определение протеолитической активности сыворотки крови по гидролизу протаминсульфата

Плазма (сыворотка) крови содержит ферменты протеолиза с трипсиноподобной активностью, основными представителями которых являются плазмин, калликреин, тромбин. Белковые субстраты, применяемые для определения активности препаратов протеолитических ферментов, не расщепляются протеиназами плазмы (сыворотки). Исключение составляет протаминсульфат, который гидролизуется протеолитическими ферментами плазмы (сыворотки) крови.

В основу разработанного метода определения активности сыворотки крови положено определение аргинина, отщепившегося от протаминсульфата под действием протеиназ плазмы. Реактивы:

• Плазма крови. Кровь берут из локтевой вены сухим шприцем натощак в пробирку, содержащую 1 объем антикоагулянта (3,8% раствора лимоннокислого натрия) на 9 объемов крови. Плазму отделяют центрифугированием крови при 3000 об/мин в течение 15 мин. Гемолизированную и липоидную плазму использовать нельзя.
• 3,8% раствор лимоннокислого Na.
• Мединаловый буфер 0,05 М, рН 7,6. 10,3 г мединала растворяют в 500 мл дистиллированной воды, 61,5 мл этого раствора смешивают с 38,5 мл НСl и добавляют дистиллированную воду до 200 мл.
• 1% раствор протаминсульфата. Пригодны препараты субстрата с минимальным количеством аргининсодержащих пептидов. Для определения возможности использования препаратов протаминсульфата ставят пробу на наличие в них пептидов, растворимых в трихлоруксусной кислоте (ТХУ) и дающих цветную реакцию Сакагуши. С этой целью к 0,2 мл 1% раствора протаминсульфата прибавляют 0,6 мл мединалового буфера, 0,05 М, рН 7,6, и 0,8 мл 20% раствора ТХУ. Пробы центрифугируют при 5000 об/мин в течение 40 мин и в 1 мл ТХУ центрифугата определяют содержание аргинина по цветной реакции Сакагуши спектрофотометрически при 508 нм в кюветах толщиной слоя 10 мм против контроля на реактивы (0,5 мл мединалового буфета + 0,5 мл 20% ТХУ + реактивы для реакции Сакагуши). Оптическая плотность пробы, характеризующая количество аргининсодержащих пептидов применяемого препарата протаминсульфата, не должна превышать 0,25. Если она выше указанного показателя, то такие препараты субстрата не пригодны. Для приготовления 1% раствора протаминсульфата непосредственно перед опытом навеску препарата тщательно растирают в 0,05 М мединаловом буфере, рН 7,6 в течение 15 минут.
• 20% раствор ТХУ.
• 0,02% раствор оксихинолина. 20 мг перекристаллизованного оксихинолина растворяют в 10 мл этилового спирта (96°) и хранят при температуре +4° С, перед опытом его разбавляют в 10 раз дистиллированной водой.
• 10% раствор NaOH.
• 1% раствор NaBrO 1 г (0,32 мл) брома растворяют в 100 мл 5% раствора NaOH.
• 40% раствор мочевины.
• Аргинин солянокислый. Используют для построения калибровочной кривой.

Ход определения. В 2 пробирки — опытную и контрольную — отмеривают по 0,1 мл плазмы (сыворотки) крови и 0,5 мл 0,05 М мединалового буфера, рН 7,6. В опытную пробу вносят 0,2 мл 1% раствора протаминсульфата. Обе пробы инкубируют 15 минут при температуре 35°С, после чего реакцию останавливают добавлением 0,8 мл 20% раствора ТХУ. К контрольной пробе затем прибавляют 0,2 мл протаминсульфата, предварительно выдержанного 15 минут при 35°С. После перемешивания пробы центрифугируют 45 минут при 5000 об/мин. В цельном прозрачном центрифугате определяют содержание аргинина по реакции Сакагуши следующим образом. В конические колбы (емкостью 25-50 мл) вносят 1 мл дистиллированной воды, 1 мл центрифугата, 1 мл 0,02% раствора оксихинолина и 1 мл 10% раствора NaOH. Через 2 минуты добавляют 0,2 мл 1% раствора NaBrO, спустя 15 секунд - 1 мл 40% раствора мочевины и по истечении 45 секунд - 1 мл дистиллированной воды. После добавления каждого реактива пробы тщательно перемешивают. Через 10 минут определяют оптическую плотность растворов при 508 нм на спектрофотометре или нефелометре (кювета с толщиной слоя 10 мм), сравнивая опытную пробу с контрольной. Мерой активности фермента служит количество аргинина в пробе. Его рассчитывают по калибровочной кривой, которую строят следующим образом. 60,5 мг аргинина растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Исходный раствор содержит 1000 мкг аргинина в 1 мл. Рабочий раствор готовят путем разбавления исходного раствора до концентрации 50 мкг/мл. Калибровочная кривая строится в пределах от 5 до 40 мкг аргинина (0,1-0,8 мл) в пробе. На оси абсцисс откладывают количество аргинина (мкг), на оси ординат -показатели оптической плотности при 508 нм. ПРА плазмы крови выражают в мкмоль аргинина, отщепленного от протаминсульфата 100 мл плазмы за 1 минуту.

Пример расчета. Например, оптическая плотность центрифугата равна 0,12, по калибровочной кривой это соответствует 5 мкг аргинина. Общий объем пробы - 1,6 мл, время инкубации плазмы с протаминсульфатом — 15 минут, на определение взято 0,1 мл плазмы, молекулярная масса аргинина - 174,2. Следовательно, ПРА данного образца плазмы равна: (5*1,6*100)/(0,1*15*174,2) = 3,1 мкмоль аргинина / (мин *100 мл плазмы)

В плазме крови здоровых людей ПРА в среднем составляет 4,2 мкмоль аргинина (колебания 2,5-6,5 мкмоль).

Определение фибринолитической активности плазмы крови

Плазма крови человека в норме обладает незначительной фибринолитической активностью, так как большая часть плазмина находится в виде неактивного предшественника — плазминогена. Последний под влиянием тканевых и бактериальных активаторов превращается в активный фермент — плазмин. Кроме того, плазминоген активируется при обработке плазмы чужеродными частицами — каолином, целитом и др. Этот контактный механизм образования плазмина осуществляется путем предварительной активации ФХ, который непосредственно или через активацию проактиваторов катализирует превращение плазминогена в плазмин.

Для определения образовавшегося плазмина в условиях контактной активации плазмы был разработан метод его определения с помощью субстрата протаминсульфата.

В основу двух методов положена способность плазминогена разбавленной плазмы в кислой среде активироваться каолином. Активированный фермент (плазмин) определяется во фракции эуглобулинов плазмы по лизису сгустков фибрина и расщеплению протаминсульфата.

Определение фибринолитической активности по лизису фибриновых сгустков

В основу метода положена способность плазмина, образующегося при обработке плазмы каолином, расщеплять фибрин. Реактивы:

• 0,4% раствор бычьего фибриногена.
• 1 % раствор каолина.
• 0,01 М ацетатный буфер, рН 4,8.
• 0,5% раствор тромбина.
• Плазма крови. Взятие крови проводили в полиэтиленовые пробирки, содержащие 1 объем 1,34% раствора щавелевокислого натрия в расчете на 9 объемов крови. Плазму отделяли путем центрифугирования крови при 3000 об/мин в течение 10 минут.
• Эуглобулиновый осадок. Его получают из плазмы крови следующим образом. В полиэтиленовые пробирки, содержащие 0,5 мл плазмы, прибавляют 9,25 мл ацетатного буфера, 0,01 М, рН 4,8, и сразу же вносят 0,25 мл 1% суспензии каолина. Активацию плазмы каолином проводят 45 мин при 37°С, периодически перемешивая пробы деревянной палочкой. Затем их центрифугируют 5 минут при 3000 об/мин. Центрифугат тщательно сливают, пробирку осушивают фильтровальной бумагой, а полученный эуглобулиновый осадок суспендируют в 0,5 мл 0,05 М мединалового буфера, рН 7,6. Активность образовавшегося плазмина определяют в суспензии эуглобулинов по скорости гидролиза фибрина.

Ход определения. В прозрачные полиэтиленовые пробирки вносят 0,2 мл суспензии эуглобулинов, 0,3 мл 0,05 М мединалового буфера, рН 7,6, затем добавляют 0,1 мл 0,4% раствора бычьего фибриногена и сразу же 0,1 мл 0,5% раствора тромбина помещают на водяную баню при 37°С. С момента добавления тромбина отмечают время лизиса фибриновых сгустков, которое и служит мерой фибринолитической активности плазмина. В норме оно составляет в среднем 16 минут (колебания 10-30 минут).

Определение активности плазмина по расщеплению протаминсульфата

Метод основан на способности плазмина, образующегося при обработке плазмы каолином в кислой среде, отщеплять от протаминсульфата аргинин, количество которого служит мерой активности фермента. Реактивы:

• 1,34% раствор щавелевокислого Na.
• 0,01 М ацетатный буфер, рН 4,8.
• 1 % раствор белой глины — каолина.
• 1% раствор протаминсульфата.
• 0,05 М мединаловый буфер, рН 7,6.
• 20% раствор ТХУ, 0,02% - оксихинолина, 10% - NaOH, 1% - NaBrO.
• 40% раствор мочевины.
• Аргинин солянокислый для построения калибровочной кривой.
• Плазма крови.
• Эуглобулиновый осадок.

Ход определения. В опытные пробирки вносят 0,1 мл суспензии эуглобулинового осадка и 0,5 мл 0,05 М, рН 7,6 мединалового буфера, затем прибавляют 0,2 мл 1% раствора протаминсульфата и инкубируют при температуре 37°С в течение 30 мин. Реакцию останавливают 0,8 мл 20% раствора ТХУ. Контрольные пробы проводят аналогично, но субстрат вносят после ТХУ. Контрольные и опытные пробы центрифугируют 40 минут при 5000 об/мин и в 1 мл центрифугата определяют содержание аргинина по цветной реакции Сакагуши.

Активность каолинактивируемого плазмина (АКП) выражают в мкмоль аргинина, отцепившегося от протаминсульфата за 1 минуту 100 мл плазмы крови. Ее рассчитывают по формуле:

АКП = (C*V1*100)/(T*V*174,2), где С — количество аргинина (мкг), освободившееся из протаминсульфата и определяемое по калибровочной кривой; V1 — общий объем реакционной смеси (1,6 мл); Т — время инкубации эуглобулинового осадка с протамин-сульфатом (30 минут); V — объем эуглобулиновой фракции, взятый для анализа (0,1 мл); 174,2 — молекулярная масса аргинина.

В плазме крови здоровых людей активность каолинактивируемого плазмина в среднем равна 8 мкмоль аргинина. (Колебания 6-11 мкмоль аргинина).