ГлавнаяЭнзимология

Ингибиторы трипсина

Среди различных групп протеолитических (белокгидролизующих) ферментов в клинике и, в частности, в отоларингологии наиболее широко апробированы протеиназы поджелудочной железы — трипсин и химотрипсин.

Трипсин синтезируется ацинозными клетками поджелудочной железы в виде неактивного предшественника трипсиногена, который поступает в двенадцатиперстную кишку и активируется энтерокиназой кишечного сока. Это было установлено Н. П. Шеповальниковым в лаборатории И. П. Павлова. Активация трипсиногена достигается гидролизом единственной пептидной связи около N-конца полипептидной цепи с освобождением гексапептида и образованием активной формы фермента.

Молекула трипсина состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 23800. Последовательность аминокислотных остатков в молекуле этого фермента расшифрована полностью. Фермент имеет щелочные свойства: его изоэлектрическая точка находится при рН 10,1. Трипсин, как и химотрипсин, гидролизует пептидные связи, находящиеся внутри молекулы различных белков. Поэтому их называют эндопептидазами, в отличие от экзопептидаз, которые отщепляют концевые аминокислотные остатки в молекулах белков и пептидов. Большинство изолированных природных белков слабо переваривается протеиназами поджелудочной железы, однако их гидролиз резко усиливается после денатурации. В то же время некоторые нативные белки (например, фибриноген) очень быстро расщепляются трипсином.

Трипсин катализирует гидролиз преимущественно пептидных связей в молекулах белков, в которых карбоксильная группа образована основными аминокислотами с положительно заряженной боковой цепью—аргинином или лизином. При определенных условиях можно установить его действие и на иные связи. Наряду с белками трипсин расщепляет и низкомолекулярные субстраты — сложные эфиры и амиды, т. е. обладает эстеразной и амидазной активностью. Скорость гидролиза сложных эфиров значительно выше, чем соответствующих амидов. Для определения активности трипсина чаще всего используют такие белковые субстраты, как гемоглобин и казеин, а из синтетических — N-замещенные эфиры аргинина и лизина: БАЭЭ, N-тозил-Z-аргининметиловый эфир (ТАМЭ), БАПНА.

Трипсин в определенных концентрациях ускоряет свертывание крови, катализируя реакцию превращения протромбина в тромбин.

Важным свойством, представляющим интерес не только в теоретическом, но и в практическом плане, является способность трипсина подвергаться при физиологическом значении рН самоперевариванию (аутолиз). При этом трипсин расщепляется на ряд фрагментов с потерей ферментативной активности. Аутолитическая инактивация наблюдается уже при рН свыше 5; она особенно сильно выражена при рН 7-9. Например, при рН 7,5 и температуре 36°С трипсин в концентрации 1 мг/мл, обычно применяемой в клинике, теряет за 2 ч около 85% своей исходной активности. Добавление к раствору трипсина (1 мг/мл) ионов кальция до концентрации 0,004М в значительной степени предохраняет фермент от инактивации.

Для медицинских целей трипсин получают из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Метод основан па предварительном выделении из кислого экстракта железы (рН 3) профермента — трипсиногена с помощью фракционного высаливания. В кислой среде трипсиноген стабилен, легко растворим и спонтанно не активируется, что является необходимым условием для получения в последующем активной формы фермента. Трипсиноген кристаллизуется при рН 8 на холоде при 50% насыщении сернокислым магнием. Обычно в этих условиях при длительном выдерживании смеси трипсин кристаллизуется. После удаления солей диализом растворы трипсина стерилизуют, фильтруя через фильтры Зейтца, разливают во флаконы и высушивают методом лиофилизации. Обычно из 10 кг поджелудочной железы получают 5—6 г кристаллического трипсина. Для парентерального введения применяют только кристаллический трипсин, для местного — аморфный трипсин и химопсин (смесь трипсина и химотрипсина). Форма выпуска кристаллического трипсина — герметически закрытые флаконы по 0,01 г кристаллического белка-фермента. Химопсин расфасовывается во флаконы по 0,025, 0,05 и 0,1 г. Эти препараты легко растворимы в воде и физиологическом растворе. Флаконы с ферментом хранят в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 10°С. Срок годности препарата указывается на флаконе.

Альфа-химотрипсин синтезируется поджелудочной железой в виде неактивного предшественника — химотрипсиногена. Сейчас установлено, что ацинозные клетки железы продуцируют два химотрипсиногена — А и Б, которые различаются между собой физико-химическими свойствами: первый из них имеет катионные свойства, второй — анионные. Проферменты активируются в двенадцатиперстной кишке под действием трипсина. Наиболее изучена активация химотрипсиногена А, которая происходит под влиянием небольших доз трипсина (10 000 весовых частей профермента и 1 часть трипсина). В результате активации образуется несколько активных форм химотрипсина — альфа, бета, гамма, которые отличаются друг от друга по форме кристаллов и растворимости.

Для медицинских целей используют альфа-химотрипсин — белок с молекулярной массой 25000 и ИЭТ при рН 8,1-8,3. Максимальная зона устойчивости наблюдается при рН 3. Альфа-химотрипсин состоит из трех полипептидных цепей, которые в третичной структуре стабилизированы водородными связями. В настоящее время с помощью рентгеноструктурного анализа полностью расшифрованы третичная структура альфа-химотрипсина и строение его активного центра.

Химотрипсин гидролизует пептидные связи, карбонильная группа которых принадлежит остаткам ароматических аминокислот — фенилаланина, триптофана или тирозина. Однако он способен расщеплять в белках и другие связи. Аналогично трипсину химотрипсин обладает эстеразной и амидазной активностями, и сложные эфиры гидролизуются им значительно быстрее, чем амиды. В то же время химотрипсин в отличие от трипсина обладает способностью свертывать молоко, а также расщеплять де-вятичленный полипептид — брадикинин с потерей его биологической активности. Химотрипсин в слабощелочной среде подвергается автолизу, хотя и в меньшей степени, чем трипсин. Скорость автолиза химотрипсина резко возрастает с повышением температуры: при 30° С она в 30 раз выше, чем при 5°С. Исследование скорости автолиза при разных значениях рН (7-11) показало, что максимальная инактивация фермента наблюдается при рН 9,1-9,2. Хлористый калий оказывает стабилизирующее действие.

Медицинские препараты альфа-химотрипсина выделяют из поджелудочной железы быка. Вначале из кислого экстракта железы получают кристаллический химотрипсиноген, который 5 раз перекристаллизовывают, а затем активируют трипсином. Полученный фермент после стерилизации расфасовывают во флаконы по 0,01 г, лиофилизируют. Препарат хранится при температуре не выше 10°С. Как и трипсин, в сухом виде фермент устойчив.

В клинической отоларингологии протеиназы завоевали наибольшее признание. Предпосылкой к этому явились данные о том, что протеолитические ферменты поджелудочной железы обладают рядом лечебных свойств, проявляющихся при местном и парентеральном введении.

При локальном применении (аппликации, инстилляции, аэрозольные ингаляции, введение в полости, электрофорез) протеиназы проявляют высокую литическую активность в отношении нежизнеспособных тканей, сгустков крови. Характерным их свойством является способность избирательно расщеплять денатурированные белки некротических масс, практически не действуя на живые ткани, т. е. при помощи энзиматического лизиса из организма преимущественно удаляются белки омертвевших тканей. Такое избирательное действие ферментов объясняется наличием в неповрежденных тканях специфических ингибиторов, которые блокируют активность энзимов. Малая чувствительность природных (нативных) белков к действию протеиназ также связана с пространственными препятствиями, с недоступностью пептидных связей для активного центра фермента. При денатурации развертывается белковая молекула, в результате чего «обнажаются» пептидные связи, которые становятся более доступными для гидролиза ферментами.

Наряду с некролитическим действием протеиназы обладают муколитическим эффектом, т. е. способностью расщеплять различные экссудаты и гнойные массы. Разжижая гнойные экссудаты, ферменты понижают их вязкость, что приводит к улучшению дренажной функции в области очага воспаления и созданию условий для ускорения регенерации ткани. Муколитическое свойство ферментов широко используется клиницистами при заболеваниях, ведущим симптомом которых является наличие вязкого трудноотделяемого экссудата. Благодаря активному расщеплению и удалению некротических масс белков экссудата создаются неблагоприятные условия для микроорганизмов, а также улучшается контакт антибактериальных препаратов с микробной клеткой. В гнойном экссудате эффект антибиотиков ослаблен или вовсе отсутствует.

Большинство ученых полагают, что протеиназы могут оказывать косвенное влияние на микрофлору, механизм которого полностью не расшифрован. Ученые показали уменьшение количества туберкулезных палочек и неспецифической микрофлоры при интракавернозном введении трипсина, что объясняется устранением благоприятной среды для размножения микроорганизмов. Протеиназы разрушают ряд вирусов и бактериальных токсинов. Культура вируса Herpes simplex после обработки 0,5% раствором трипсина в течение 10 минут инактивируется и теряет способность адсорбироваться на оболочках живых клеток. Трипсин также снижает инфекционность и антигенные свойства вируса ящура. Установили, что под влиянием трипсина стафилококковый токсин почти полностью теряет антигенные свойства.

Важное лечебное свойство ферментов протеолиза заключается в способности повышать эффективность антибактериальных препаратов. Согласно данным исследований, сочетанное парентеральное применение химотрипсина с линкомицином при экспериментальной стафилококковой инфекции уменьшает обсемененность микрофлорой внутренних органов, патогенность культуры стафилококков, снижает смертность животных, приводит к утрате лецитиназной и плазмокоагулирующей активностей. Механизм этого действия частично связан со способностью протеиназ, вводимых парентерально, повышать концентрацию антибиотиков в тканях и крови. Под воздействием ферментов нарушается прочность пиогенной мембраны, и антибиотики в более высоких дозах могут проникать в очаг воспаления.

Свойство протеиназ повышать концентрацию антибиотиков в тканях используется клиницистами в тех случаях, когда необходимы более высокие их концентрации в тканях, а также затруднен доступ антибактериальных препаратов в очаг поражения из-за наличия некротических масс.

Ферменты не только усиливают активность антибиотиков, но и способствуют снижению резистентности к ним различной микрофлоры. Израильские ученые установили, что у больных с гнойными процессами в легких, которых лечили антибиотиками в сочетании с протеолитическими ферментами животного и бактериального происхождения, уменьшается количество штаммов микроорганизмов, устойчивых к левомицетину, эритромицину и мономицину; микрофлора адаптируется к антибиотикам в этих случаях медленнее, чем у больных, получавших только антибиотики. Согласно экспериментальным данным, под влиянием комбинированного лечения химотрипсином и линкомицином штаммы стафилококков, выделенные из организма животных, приобретают чувствительность к тем антибиотикам, к которым они были малочувствительны или вовсе не чувствительны.

При совместном локальном введении ферментов и антибиотиков необходимо учитывать, что ряд широко применяемых антибиотиков (пенициллин, колимицин, мицерин) подавляют активность ферментов. Препараты пенициллина, выпускаемые различными заводами, снижают активность фермента в неодинаковой мере.

В результате клинико-экспериментальных исследований установлено, что протеиназы поджелудочной железы оказывают противовоспалительное и особенно противоотечное действие, которое выражено при внутримышечном и защечном введении. Механизм этого действия весьма сложен, так как в тканях и крови содержатся специфические вещества, блокирующие активность экзогенно вводимого фермента. Противовоспалительное свойство протеиназ, обусловленное специфической протеолитической активностью фермента, а не белковой молекулой как таковой, проявляется после всасывания ферментов в кровь. Исследования показали наличие в сыворотке крови активного трипсина после его внутримышечного введения. Попадая в кровь, трипсин связывается с белковыми ингибиторами альфа-глобулиновых фракций и в таком состоянии не расщепляет белковые субстраты (казеин, гемоглобин, белки крови), но сохраняет способность гидролизовать щелочной белок протамин. Используя это свойство ферментов, предложили специфический метод определения парентерально вводимого фермента.

Таким образом, в циркулирующей крови отсутствует свободный трипсин и, вероятно, другие трипсиноподобные протеиназы. Они находятся в связанном состоянии с альфа-глобулинами плазмы, причем фермент, связанный с альфа2-МГ, проявляет ограниченную активность. Как показали исследования, уже через несколько часов после внутривенного введения трипсина концентрация его в периферической крови резко снижена, а через сутки он полностью исчезает. При внутримышечном введении трипсин не определяется в циркулирующей крови животных уже через несколько часов. Это нельзя отнести за счет его спонтанной инактивации, очевидно, он может задерживаться тканями.

Следовательно, всасываясь в кровь, потенциально активный фермент переносится к тканям в виде комплекса альфа2-МГ — трипсин. Остается невыясненной природа субстратов, которые в очаге поражения расщепляются комплексом альфа2-МГ — протеиназа, что приводит к ликвидации воспалительных реакций. Можно полагать, что парентерально вводимые протеиназы действуют на вазоактивные полипептиды типа брадикинина. Химотрипсин, в частности, обладает способностью расщеплять брадикинин с потерей его биологической активности. Можно допустить, что инактивация брадикинина и его аналогов может явиться одним из механизмов, ответственных за противовоспалительное действие протеолитических ферментов.

Все материалы на сайте размещены для справки. Перед началом лечения проконсультируйтесь с врачом.